1,8-cineolio degradaciją koduojančio operono iš Rhodococcus sp. TMP1 charakterizavimas

Anotacija

Sparčiai vystantis biotechnologijoms, didėja įvairių biokatalizinių procesų poreikis. Vienas svarbiausių biokatalizę ribojančių veiksnių – pradinių medžiagų ir produktų prigimtis bei įvairovė. Terpenai, jų dariniai terpenoidai yra didžiausia gamtinių medžiagų grupė, pasižymi junginių įvairove ir yra biologiškai aktyvių medžiagų pirmtakai. Dėl šių priežasčių terpenų biotransformacijos panaudojant mikroorganizmus sulaukia daug dėmesio. 1,8-cineolas, arba eukaliptolas, yra plačiai paplitęs monoterpenoidas, pasižymintis antimikrobinėmis ir antigrybelinėmis savybėmis. 1,8-cineolas naudojamas farmacijos, žemės ūkio, maisto ir kosmetikos pramonės srityse. Nustatyti tik pirmose dviejose 1,8-cineolo skaidymo reakcijose dalyvaujantys baltymai ir juos koduojantys genai Citrobacter braakii bakterijose. Nėra informacijos apie genus, koduojančius tolimesniuose 1,8-cineolo degradacijos etapuose dalyvaujančius fermentus.
Šiame darbe parodyta, kad Rhodococcus jostii TMP1 bakterijos gali panaudoti 1,8-cineolą, kaip vienintelį anglies ir energijos šaltinį. Bioinformatinės R. jostii TMP1 genomo analizės metu buvo aptiktas pilnesnis CIN operonas – CINTMP1. Nustatyta, kad CINTMP1 operone lokalizuoti genai pasižymi didele homologija su genais, dalyvaujančiais skaidant 1,8-cineolą C. braakii bakterijose. Išsiaiškinta, kad šie genai – cinA1, cinB1, cinC1, cinD1 ir cinBVMO – koduoja atitinkamai citochromo P450 šeimos fermentą (P450cin), cindoksino reduktazę, cindoksiną, hidroksicineolo dehidrogenazę ir Baeyer-Villiger monooksigenazę (BVMO). Ištirtos ir optimizuotos rekombinantinių P450cin, cindoksino, hidroksicineolo dehidrogenazės ir BVMO baltymų sintezės sąlygos. Nustatytos cinA1, cinC1 ir geno, koduojančio Escherichia coli feredoksino reduktazę, koekspresijos sąlygos. Parodyta, kad rekombinantinis P450cin katalizuoja 1,8-cineolo virtimą 6-hidroksicineolu. Be to, nustatyta, kad P450cin gali oksiduoti 6-hidroksicineolą iki 6-ketocineolo.